本发明涉及用于假单胞菌属细菌的可控表达载体及应用及控制目的蛋白产物或mRNA产生的方法,具体涉及在铜绿假单胞菌PAO1中czcCBA的表达受锌、铜离子调控的现象,基于此调节机制构建的用于假单胞菌属细菌的可控表达载体,以及应用此表达载体在假单胞菌属细菌中控制目的基因产物或mRNA产生的方法。解决了现有的蛋白表达载体只表达不可控的技术问题,实用性强。
1.一种用于假单胞菌属细菌的可控表达载体,其特征在于:所述载体采用以下方法制备:1】把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域连入质粒pMS402,得到过渡载体4;或把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域连入质粒pHP45-omega,得到过渡载体4;从过渡载体4上取一段包含基因簇czcCBA的启动子区域和终止子的序列1;2】去掉质粒pUCP26中的多克隆位点和启动子PLac区域,得到中间片段2;把序列1和中间片段2连接成中间载体3;3】用PCR扩增,从表达载体pPROEXxa0HT的pPROEXxa0HTa中得到第一片段D1、从pPROEXxa0HTb中得到第二片段D2、从pPROEXxa0HTc中得到第三片段D3,所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别包括多克隆位点和多聚组氨酸标签;4】将所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别连入中间载体3,得到用于假单胞菌属细菌的可控表达载体pLY,所述可控表达载体pLY相应包括pLY-A、pLY-B、pLY-C。技术领域
本发明属生物技术领域,具体涉及在铜绿假单胞菌PAO1中czcCBA的表达受锌、铜离子调控的现象,基于此调节机制构建的用于假单胞菌属细菌的可控表达载体,以及应用此表达载体在假单胞菌属细菌中控制目的基因产物或mRNA产生的方法。
背景技术
假单胞菌属细菌,在自然界中广泛存在,对动、植物也具有一定的危害性,能引发多种疾病和农作物病害(Microbiolxa0Rev,1996,60:539-74.Jxa0Bacteriol,2008,190(8):2858-2870.);但同时,假单胞菌属细菌已经被应用于生物诊断、生物除污和蛋白工业化生产等领域(Biosensors&bioelectronics,2001,16:337-353.Jxa0IndMicrobiolxa0Biotrchnol,2005,32(4):148-154.Annuxa0Revxa0Phytopathol,2005,43:337-59.)。铜绿假单胞菌是假单胞菌属的代表菌种,是一类机会致病菌,它对人类的危害,随着其耐药性的增强而日益严重,细菌的多重耐药性在全世界范围内扩增,威胁着整个人类的健康以及生存。所以,对假单胞菌属细菌,尤其是铜绿假单胞菌的研究,对了解其蛋白功能、耐药性产生原因和指导用药,以及其他领域的应用均有重要意义。传统的蛋白表达载体,一般是在大肠杆菌中表达,并受到IPTG的诱导,如表达载体pPROEXxa0HT(Invitrogen)、pMAL-PEA原核分泌型表达载体(解放军医学杂志,2004,29(2):156-8.)等。还有一些表达载体在假单胞菌中可以表达,但是其表达式不可控的,如pYMB03(应用与环境生物学报,2008,14(4):528-33)。因此,在自身环境下,研究一些蛋白功能还存在这一些不便,如持家基因的确定,融合蛋白的可控表达等。所以,构建一种在铜绿假单胞菌中可控的表达载体,对解决这些问题有重要作用。
发明内容
为了解决现有的蛋白表达载体只表达不可控的技术问题,本发明提供了一种利用锌、铜等金属离子对铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域以及假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA表达有开关及调控作用,构建了一套假单胞菌属细菌中工作的表达载体,通过控制锌、铜离子的浓度,达到控制目的基因表达量的目的,包括确定假单胞菌属细菌的持家基因、mRNA表达、互补试验等。本发明的技术解决方案:一种用于假单胞菌属细菌的可控表达载体,其特殊之处在于:所述载体采用以下方法制备:1】把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域前加入终止子,得到过渡载体4,从过渡载体4上取一段包含基因簇czcCBA的启动子区域和终止子的序列1;2】去掉质粒pUCP26中的多克隆位点和启动子PLac区域,得到中间片段2;把序列1和中间片段2连接成中间载体3;3】用PCR扩增,从表达载体pPROEXxa0HT的pPROEXxa0HTa中得到第一片段D1、从pPROEXxa0HTb中得到第二片段D2、从pPROEXxa0HTc中得到第三片段D3,所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别包括多克隆位点和多聚组氨酸标签;4】将所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别连入中间载体3,得到用于假单胞菌属细菌的可控表达载体pLY,所述可控表达载体pLY相应包括pLY-A、pLY-B、pLY-C。上述把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域前加入终止子的方法是把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域连入质粒pMS402或把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域连入质粒pHP45-omega。用于假单胞菌属细菌的可控表达载体在纯化中的应用。用于假单胞菌属细菌的可控表达载体在发酵或重金属浓度检测中的应用。一种控制目的蛋白产物或mRNA产生的方法,其特殊之处在于:其包括以下步骤:1】取铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域;2】组建以铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域为核心组成元件的载体A;3】把载体A转入生长在培养基中的假单胞菌属细菌或整合至生长在培养基中的假单胞菌属细菌的染色体上;4】在步骤3】中所述的培养基中加入二价锌离子或二价铜离子,控制目的蛋白产物的产生或mRNA的产生。上述组建以铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域为核心组成元件的载体A的具体步骤:2.1】把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域前加入终止子,得到过渡载体4,从过渡载体4上取一段包含铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域和终止子的序列1;2.2】去掉质粒pUCP26中的多克隆位点和启动子PLac区域,得到中间片段2;把序列1和中间片段2连接成中间载体3;2.3】用PCR扩增,从表达载体pPROEXxa0HT的pPROEXxa0HTa中得到第一片段D1、从pPROEXxa0HTb中得到第二片段D2、从pPROEXxa0HTc中得到第三片段D3,所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别包括多克隆位点和多聚组氨酸标签;2.4】将所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别连入中间载体3,得到用于假单胞菌属细菌的可控表达载体pLY,所述可控表达载体pLY相应包括pLY-A、pLY-B、pLY-C;2.5】选取插入不含核糖体结合位点(RBS)的目的基因片段到多克隆位点后,能够使铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因起始密码子到目的基因起始密码子的碱基数是3的整数倍的可控表达载体(pLY-A、pLY-B、pLY-C)中的一个;把不含核糖体结合位点(RBS)的目的基因片段连入选取的该载体的多克隆位点,形成第二载体E;上述在培养基中加入二价锌离子或二价铜离子,控制目的基因的蛋白产物的产生或mRNA的产生的具体步骤:在培养基中加入二价锌离子或二价铜离子,控制目的基因的蛋白产物的产生或mRNA的产生;所述二价锌离子浓度范围为10μM~7mM,二价铜离子浓度范围为10μM~30mM。上述组建以铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域为核心组成元件的载体D的具体还可以包括以下步骤:2.1】把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域前加入终止子,得到过渡载体4,从过渡载体4上取一段包含基因簇czcCBA的启动子区域和终止子的序列1;2.2】去掉质粒pUCP26中的多克隆位点和启动子PLac区域,得到中间片段2;把序列1和中间片段2连接成中间载体3;2.3】用PCR扩增,从表达载体pPROEXxa0HT的pPROEXxa0HTa中得到第一片段D1、从pPROEXxa0HTb中得到第二片段D2、从pPROEXxa0HTc中得到第三片段D3,所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别包括多克隆位点和多聚组氨酸标签;2.4】将所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别连入中间载体3,得到用于假单胞菌属的可控表达载体pLY,所述可控表达载体pLY相应包括pLY-A、pLY-B、pLY-C;2.5】任取可控表达载体pLY中的一个,把含有核糖体结合位点(RBS)的目的基因片段,连入该载体的多克隆位点,形成第三载体F;上述在步骤3】的培养基中加入二价锌离子或二价铜离子,控制目的基因的蛋白产物的产生或mRNA的产生的具体步骤:在培养基中加入二价锌离子或二价铜离子,通过加入离子浓度的不同,控制目的基因表达量的不同,进而控制目的蛋白产物的产生或mRNA的产生;所述二价锌离子浓度范围为10μM~7mM,二价铜离子浓度范围为10μM~30mM。一种控制目的蛋白产物或mRNA产生的方法,其包括以下步骤:1】在铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA或假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA同源基因的启动子区域后,连入一段目的基因,得到生长在培养基中的重组菌株;2】在生长有重组菌株的培养基中加入二价锌离子或铜离子,控制目的基因的蛋白产物的产生或mRNA的产生。上述步骤1】是在铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA及假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA同源基因的启动子区域后,直接连入一段含有核糖体结合位点RBS的目的基因,得到生长在培养基中的重组菌株F。上述步骤1】是选取铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA或假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA同源基因的起始密码子到目的基因起始密码子的碱基数是3的整数倍的位置连入不含核糖体结合位点(RBS)的目的基因,得到生长在培养基中的重组菌株G。本发明所具有的有益效果:本发明提供了一种利用锌、铜等金属离子对铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA表达有开关及调控作用,构建了一套假单胞菌属细菌中工作的表达载体,通过控制锌、铜离子的浓度,达到控制目的基因表达量的目的,实用性强。
附图说明
图1为β-半乳糖苷酶试验的表达曲线,lacZ插入到铜绿假单胞菌PAO1染色体上,基因簇czcCBA的czcC中间,锌离子在培养基中浓度为500μM(菱形),400μM(星号),300μM(方块),200μM(十字),100μM(圆形)和0μM(三角);图2为铜绿假单胞菌PAO1(pKD-czc)在BHI培养基中含有不同浓度锌离子时的表达曲线,锌离子在培养基中浓度为500μM(菱形),250μM(方块)和0μM(三角);图3为可控表达载体pLY-A的图谱,pLY-B在酶切位点BamHI前与pLY-A相比多了一个碱基g,pLY-C在酶切位点BamHI前与pLY-A相比多了两个个碱基g;图4为铜绿假单胞菌PAO1(pLY-B-LuxABCDE)在含有不同锌离子浓度的肉汤培养基(LB)固体平板上的发光情况:a图是白光图片,b图是化学发光片图;图5为铜绿假单胞菌PAO1(pLY-C-SacB)的生长情况照片:脑心浸液(BHI)培养基固体平板中均含有10%的蔗糖,a图中固体平板中含有0μM锌,b图中固体平板中含有200μM锌,c图中固体平板中含有400μM锌。
具体实施方式
一种用于假单胞菌属细菌的可控表达载体,载体采用以下方法制备:1】把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域前连入终止子,得到过渡载体4,从过渡载体4上取一段包含基因簇czcCBA的启动子区域和终止子的序列1;例如在铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域连入质粒pMS402得到的是报告子pKD-czc,从其上得到的序列1含有基因簇czcCBA的启动子区域、卡纳霉素抗性(KAN^R)基因和终止子。把恶臭假单胞菌KT2440中的基因簇czcCBA的启动子区域,连入质粒pHP45-omega(Genexa029,303-313,1984)上,得到过渡载体4,从过渡载体4上取一段包含基因簇czcCBA启动子区域和终止子的序列1。2】去掉质粒pUCP26中的多克隆位点和启动子PLac区域,得到中间片段2,把序列1和中间片段2连接成中间载体3;3】用PCR扩增,从表达载体pPROEXxa0HT的pPROEXxa0HTa中得到第一片段D1、从pPROEXxa0HTb中得到第二片段D2、从pPROEXxa0HTc中得到第三片段D3,所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别包括多克隆位点和多聚组氨酸标签;4】将所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别连入中间载体3,得到用于假单胞菌属细菌的可控表达载体pLY,所述可控表达载体pLY相应包括pLY-A、pLY-B、pLY-C;一种控制目的蛋白产物或mRNA产生的方法,有两种方法第一种方法,包括以下步骤:1】取铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域;2】组建以铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域为核心组成元件的载体A,具体包括以下步骤:2.1】把铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域连入质粒pMS402得到的是报告子pKD-czc,从报告子pKD-czc上取一段包含铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域、卡纳霉素抗性(KAN^R)基因和终止子的序列1;2.2】去掉质粒pUCP26中的多克隆位点和启动子PLac区域,得到中间片段2;把序列1和中间片段2连接成中间载体3;2.3】用PCR扩增,从表达载体pPROEXxa0HT的pPROEXxa0HTa中得到第一片段D1、从pPROEXxa0HTb中得到第二片段D2、从pPROEXxa0HTc中得到第三片段D3,所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别包括多克隆位点和多聚组氨酸标签;2.4】将所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别连入中间载体3,得到用于假单胞菌属细菌的可控表达载体pLY,所述可控表达载体pLY相应包括pLY-A、pLY-B、pLY-C;2.5】选取把目的基因连入多克隆位点后,能够使铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的起始密码子到目的基因起始密码子的碱基数是3的整数倍的可控表达载体(pLY-A、pLY-B、pLY-C)中的一个;把不含核糖体结合位点(RBS)的目的基因片段连入选取的该载体的多克隆位点,形成第二载体E;3】把第二载体E转入生长在培养基中的铜绿假单胞菌属细菌;4】在培养基中加入二价锌离子或铜离子,控制目的基因的蛋白产物的产生或mRNA的产生;所述二价锌离子浓度范围为10μM~7mM,二价铜离子浓度范围为10μM~30mM。第二种方法:1】取铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA的启动子区域或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域;2】组建以铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域为核心组成元件的载体D;具体包括以下步骤:2.1】在铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA或假单胞菌属中与铜绿假单胞菌PAO1基因簇czcCBA同源基因的启动子区域前加入终止子,得到过渡载体4,从过渡载体4上取一段包含基因簇czcCBA的启动子区域、卡纳霉素抗性(KAN^R)基因和终止子的序列1;2.2】去掉质粒pUCP26中的多克隆位点和启动子PLac区域,得到中间片段2;把序列1和中间片段2连接成中间载体3;2.3】用PCR扩增,从表达载体pPROEXxa0HT的pPROEXxa0HTa中得到第一片段D1、从pPROEXxa0HTb中得到第二片段D2、从pPROEXxa0HTc中得到第三片段D3,所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别包括多克隆位点和多聚组氨酸标签;2.4】将所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分别连入中间载体3,得到用于假单胞菌属的可控表达载体pLY,所述可控表达载体pLY相应包括pLY-A、pLY-B、pLY-C;2.5】任取可控表达载体pLY中的一个,把含有核糖体结合位点(RBS)的目的基因片段,连入该载体的多克隆位点,形成第三载体F;3】把第三载体F转入生长在培养基中的假单胞菌属细菌中。4】所述在培养基中加入二价锌离子或铜离子,控制目的基因的蛋白产物的产生或mRNA的产生的具体步骤:在培养基中加入二价锌离子或铜离子,通过加入离子浓度的不同,控制目的基因表达量的不同,控制目的蛋白产物的产生或mRNA的产生;所述二价锌离子浓度范围为10μM~7mM,二价铜离子浓度范围为10μM~30mM。一种控制目的蛋白产物或mRNA产生的方法,包括以下步骤:1】在铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA或假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA同源基因的启动子区域后,连入一段目的基因,得到生长在培养基中的重组菌株G;对于步骤1】有两种情况:一种是连入目的基因含有核糖体结合位点RBS:在铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA及假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA同源基因的启动子区域后,直接连入一段含有核糖体结合位点RBS的目的基因,得到生长在培养基中的重组菌株F;一种是连入目的基因不含有核糖体结合位点RBS:选取铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA或假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1染色体的基因簇czcCBA同源基因的起始密码子到目的基因起始密码子的碱基数是3的位置连入不含核糖体结合位点RBS的目的基因,得到生长在培养基中的重组菌株G。2】在生长有重组菌株F或G的培养基中加入二价锌离子或铜离子,控制目的基因的蛋白产物的产生或mRNA的产生。铜绿假单胞菌中基因簇czcCBA是金属离子抗性相关基因(Jxa0Bacteriol,1997,179:6871-9;Gene,1999,238:417-25;Jxa0Biolxa0Chem,2004,279:8761-8)。本发明通过把基因片段lacZ插入到铜绿假单胞菌PAO1基因czcC中,用β-半乳糖苷酶试验证实,二价锌离子对基因簇czcCBA的表达有着开关和调控作用(图1)。随后把基因簇czcCBA启动子区域用PCR的方法扩增出来,连入质粒pMS402(Molxa0Microbiolxa02003,50:1477-91),构建成报告子pKD-czc,转入到铜绿假单胞菌PAO1中后,也证实了这个调控机理(图2)。从铜绿假单胞菌PAO1中基因簇czcCBA启动子受锌、铜离子调节现象这一点出发,利用质粒pMS02、pUCP26和pPROEXxa0HT系统的部分结构,构建了一套低背景、可控的、在假单胞菌属细菌中工作的表达系统。从铜绿假单胞菌PAO1中基因簇czcCBA表达受锌、铜等二价金属离子严格调控的特点出发,利用质粒pMS402、pUCP26和pPROEXxa0HT构建成了一组铜绿假单胞菌属细菌可控蛋白表达载体pLY-A、pLY-B和pLY-C。通过PAO1在不同培养基中的生长情况,确定锌离子在肉汤培养基LB中有效浓度是500μM且不影响生长,在BHI培养基中是600μM且不影响生长。如本发明应用于发酵生产中的菌体裂解,可以加大锌离子浓度。在肉汤培养基(LB)中不影响生长情况下的有效浓度范围为50μM~500μM,其诱导效果在浓度为500±50μM时达到峰值,此为最佳抑制浓度;而50μg/ml被定为可用的最低诱导浓度;在脑心浸液(BHI)培养基中不影响生长情况下的有效浓度范围100μM~600μM,其诱导效果在浓度为600±50μM时达到峰值,此为最佳抑制浓度;而100μg/ml被定为可用的最低诱导浓度。当锌离子浓度达到6~7mM时,菌体能生长。以下为几种设计过程:(1)质粒pMS402是带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的载体(Molxa0Microbiol,2003,50:1477-1491)。基因簇czcCBA的启动子区域包含RBS位点经PCR扩增,模板为PAO1染色体DNA,引物根据PAO1基因组序列(Nature,2000,406:959-964)设计。基因簇czcCBA启动子,上游引物TCTCTCGAGGTTGCCGAAGTGTAAC;下游引物CAGGATCCGAAGTATCGGCATG。下划线为XhoI和BamHI用于克隆的内切酶位点。DNA聚合酶使用高保真Pfuxa0DNAxa0polymerase(Invitrogen)。PCR使用Eppendorfxa0Mastercyclerxa0Gradientxa0PCR仪,反应条件:95°C,2分钟;95°C,40秒;52°C,40秒;72°C,1分钟;30个循环;72°C,10分钟。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。(2)上述PCR产物通过XhoI和BamHI酶切位点克隆到质粒pMS402上,得到报告子pKD-czc,并转入铜绿假单胞菌PAO1中。选用不同浓度锌离子分别加入多孔板中,测量报告子pKD-czc发光的强度,检测其活性,发现其发光强度随锌离子浓度升高而增大,没有锌离子,基因簇czcCBA启动子不表达,如图2所示,这个结果和图1结果相吻合。(3)以报告子pKD-czc序列设计引物,上游引物TCCCGTGACAGGTCATTCAG;下游引物CAGGATCCGAAGTATCGGCATG。DNA聚合酶使用高保真Pfuxa0DNAxa0polymerase(Invitrogen)。反应条件:95°C,2分钟;95°C,40秒;61°C,40秒;72°C,2分钟;30个循环;72°C,10分钟。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。产物包括czcCBA基因启动子和其上游的卡纳霉素抗性基因和终止子。(4)质粒pUCP26(Jxa0Bacteriol.1982xa0Apr;150(1):60-9.),用SfiI和AflIII酶切,用T4Dxa0Axa0polymerase(NEB)对产物末端进行平滑化,得到产物与上述PCR产物进行连接,得到质粒用EcoRV验证方向,构成质粒pUCP27。(5)以pPROEX序列设计引物,上游引物GAAACAGACCATGTCGTAC;下游引物GAGTAAACTTGGTCTGACAG。分别以HTa、HTb、HTc为模板。DNA聚合酶使用高保真Pfuxa0DNAxa0polymerase(Invitrogen)。反应条件:95°C,2分钟;95°C,40秒;61°C,40秒;72°C,2分钟;30个循环;72°C,10分钟。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。(6)对(4)中得到的质粒pUCP27用BamHI酶切,末端平滑化。得到的产物分别和(5)中得到的PCR产物进行连接,用EcoRV验证方向。建成可控表达载体pLY-A、pLY-B和pLY-C。pLY-A图谱见图3。用基因簇czcCBA启动子的上游引物TCTCTCGAGGTTGCCGAAGTGTAAC引物对得到的产物分别测序。锌离子浓度的确定:为测量锌离子的有效浓度范围,在多孔板中做1/2浓度梯度测试,确定锌离子的用量。两个报道体系PAO1(pKD-czc)和PAO1(pLY-B-LuxABCDE),在不同培养基中测定锌离子最小诱导浓度和最小抑制浓度。使用含合适抗生素的LB和BHI液体培养基,在底部透明的黑色的多孔板中进行测试。报道体系PAO1(pKD-czc)和PAO1(pLY-B-LuxABCDE)过夜培养菌液,转接、稀释后接种至多孔板中。然后每孔加入不同浓度的锌离子,并以无菌过滤后的矿物油或无菌透明塑料膜覆盖。多孔板在多标记分析仪Wallacxa0Victorxa01420上,间歇震荡,每隔半小时测量其生长(OD₆₀₀)和发光值(countsxa0perxa0second,CPS)。若对基因簇czcCBA启动子有诱导,发光值则会明显升高。实施例1以报告子pKD-czc为例,以10mM硫酸锌为起始浓度作一系列梯度稀释,得到不同浓度的锌离子对基因簇czcCBA启动子呈现出不同程度的诱导作用,在LB培养基中不影响生长情况下的有效浓度范围为50μM~500μM,其诱导效果在浓度为500μM时达到峰值,此为最佳抑制浓度;而50μg/ml被定为可用的最低抑制浓度;在BHI培养基中不影响生长情况下的有效浓度范围为200μM~600μM,其诱导效果在浓度为600μM时达到峰值,此为最佳抑制浓度;而200μg/ml被定为可用的最低抑制浓度。用固体平板对所构建筛选体系对表达目的蛋白的有效性检验:用不含RBS位点luxABCDE验证表达载体pLY是否正常工作。用KpnI酶切质粒pUCP-Not-LuxABCDE,得到没有RBS位点的luxABCDE片段;经计算碱基数,选择pLY-B,用相同酶切处理后,与luxABCDE片段连接,得到产物用NotI验证方向。构建成的质粒pLY-B-LuxABCDE。把上述质粒用电转化的方法转入野生型铜绿假单胞菌PAO1,使用含有四环素(Tc,100μg/ml)的LB固体平板筛选阳性克隆。蛋白表达量的可控性(化学发光)的验证,使用LB固体培养基中四环素(Tc100μg/ml),分别混合0μM、300μM、600μM硫酸锌,摇匀倒平板。待平板凝固晾干后,将平板分为6个相等的区域,用报道体系PAO1(pLY-B-LuxABCDE)在每个区上划线,37°C下过夜培养。在荧光/化学发光成像分析系统LAS-3000中成像,观测记录发光强度及其变化。图5是不同浓度锌离子在固体培养基上对报道体系PAO1(pLY-B-LuxABCDE)生长和发光的影响。在相同条件下,这些二价锌离子浓度对PAO1(pLY-B-LuxABCDE)生长基本没有影响。但是,含0μM硫酸锌平板上生长的细菌没有发光,而在含300μM硫酸锌和600μM平板上生长的细菌有发光,但没有明显梯度增高。这一结果表明:锌离子调控质粒pLY-B-LuxABCDE上luxABCDE的蛋白表达与否,但没有明显的调控作用。图4a是实验组和对照组的白光照片;图4b是化学发光照片。图4表明pLY-B-LuxABCDE具有开关特性。含有锌离子的平板上,报告体系发光量没有明显的梯度变化,说明这组报告体系没有明显的调控作用。但是,这个体系在液体培养基中,用多标记分析仪Wallacxa0Victorxa01420不能检测到发光,说明这个启动子虽然受到锌离子的调节,但是是一个弱启动子。实施例2用含有RBS位点sacB验证表达载体pLY是否能正常工作。用上游引物5’-CGCGGATCCGGAGACATGAACGATGAACA-3’(下划线是BamHI酶切位点)和下游引物5’-CTGGAATTCGGCATTTTCTTTTGCG-3’(下划线是EcoRI酶切位点)扩增。DNA聚合酶使用高保真Pfuxa0DNAxa0polymerase(Invitrogen),以质粒pEX18-Tc(Molxa0Microbiol,1992,6:1195-204)为模板。反应条件:95°C,2分钟;95°C,40秒;58°C,40秒;72°C,1分钟;30个循环;72°C,10分钟。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到含有RBS位点的sacB片段,用BamHI和EcoRI进行酶切,和用相同酶处理的pLY-C连接。构建成的质粒命名为pLYC-SacB。把上述质粒用电转化的方法转入野生型铜绿假单胞菌PAO1,使用含有四环素(Tc,100μg/ml)的LB固体平板筛选阳性克隆。蛋白表达量的可控性(生长状况)的验证,使用BHI固体培养基(含100μg/ml的Tc),在培养基中分别加入硫酸锌0μM,200μM和400μM。摇匀倒平板。待平板凝固晾干后,将平板分为3个相等的区域,用报道菌株PAO1(pLY-C-SacB),野生型PAO1和对照菌株PAO1(pLY-C)在每个区上划线,37°C下过夜培养。观测其生长情况。若培养基中没有锌离子,报道菌株和对照菌株均生长,但野生型PAO1不生长;若培养基中有锌离子,报道菌株不生长或长的不好,说明这组蛋白表达体系具有开关作用;如果菌体生长情况随着锌离子浓度升高而变坏,则说明这组蛋白表达系统是可控的。图5表明pLY-C-SacB具有开关及调控特性。实施例3报告子pKD-czc在铜绿假单胞菌中受锌调节的现象(图2)证明,利用这个启动子,可以达到控制表达mRNA的特性,可用于基因沉默等试验。同时,这个报告子在大肠杆菌中不表达,也不受锌的诱导调节。所以,构建的表达载体只能在铜绿假单胞菌及假单胞菌属细菌中工作。实施例4基因lacZ插入到铜绿假单胞菌中基因簇czcCBA启动子后,受锌调节的现象(图1)证明,利用这个启动子,可以达到控制表达mRNA的特性,可用于基因沉默等试验。实施例5利用克隆有溶菌作用基因的此表达体系,在利用假单胞菌属细菌发酵生产过程中,菌体内涵物的释放环节,加入大量的锌离子,促使溶菌基因的表达,达到释放出细胞内含物的目的。pLY表达系统,是一个严格控制的表达系统,锌、铜离子的浓度对克隆入所述载体中的基因,在假单胞菌属细菌中mRNA、蛋白的表达量过程中有着严格的调控作用。应用:对于将不含核糖体结合位点(RBS)的目的基因片段连入选取的本发明载体的多克隆位点,并保证连入后czcCBA的起始密码子到目的基因起始密码子之间的碱基数是3的整数倍,形成第二载体E。表达目的基因得到产物含有一个组氨酸标签,因此可以利用(镍柱)蛋白纯化试剂盒进行纯化;也可以用于发酵,在载体中连入溶菌酶基因,转入假单胞菌属细菌中或整合到假单胞菌属细菌的染色体上,在假单胞菌属细菌发酵生产后期,培养基中加入合适浓度锌或铜离子,诱导溶菌酶基因表达,导致菌体裂解,释放内涵物;还可用在检测中,也就是在载体中连入lux基因或其他报道基因,转入假单胞菌属细菌中在含有合适比例环境样品的培养基中生长,通过发光程度检测环境中重金属浓度,推算出环境中重金属离子的浓度。对于含有核糖体结合位点(RBS)的目的基因片段,连入该载体的多克隆位点,形成第三载体F。这个可以用于发酵以及重金属离子的浓度检测。对于在铜绿假单胞菌PAO1的基因簇czcCBA启动子后或在假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1的基因簇czcCBA同源的基因启动子后连入一段含核糖体结合位点(RBS)的目的基因,形成重组菌株F;也可以在铜绿假单胞菌PAO1的基因簇czcCBA启动子后或在假单胞菌属细菌中与铜绿假单胞菌PAO1的基因簇czcCBA同源的基因启动子后连入一段不含核糖体结合位点(RBS)的目的基因,并保证连入后czcCBA的起始密码子到目的基因起始密码子之间的碱基数是3的整数倍,形成的重组菌株G,均可以用于发酵和检测。